Das Noonan-Syndrom ist nicht selten. Wie erkennt man es? Wie betreut man Betroffene?

Einleitung

Das Noonan-Syndrom ist eine multisystemische genetische Störung mit einer geschätzten Inzidenz von 1 auf 1.000 bis 1 auf 2.500 Lebendgeburten. Entscheidend für die Diagnose Noonan-Syndrom sind die klinischen Befunde. Die genetischen Befunde sind auch wichtig. Sie decken aber erst 80% der klinisch diagnostizierten Fälle ab. Die Hauptmerkmale des Noonan-Syndroms sind der Kleinwuchs, ein charakteristisches Gesicht mit Ptose und auffälligen Ohren, kongenitale Herzfehler, Skelettanomalien, Kryptorchismus, Fehlbildungen der Lymphgefässe und unterschiedliche Ausprägungen an Entwicklungsverzögerung¹⁾.

Das Noonan-Syndrom ist in fast allen Fällen Folge einer autosomal-dominanten Mutation. In etwa 50 % der Fälle tritt diese Mutation de novo auf. Die klinischen Merkmale des Noonan-Syndroms sind ziemlich variabel und teilweise abhängig von der Art der Mutation. Im Jahr 1965 wurde das Syndrom nach der amerikanischen Kardiologin Jacqueline Noonan benannt. Die Wichtigkeit einer eindeutigen diagnostischen Zuteilung für Eltern und Kind wird oft unterschätzt.  Für die Eltern ist selbst eine schlimme Wahrheit meist weniger zermürbend als Unsicherheit und Angst, bei ihrem Kind könnte etwas verpasst werden oder ihr Kind könnte nicht die Beste aller Behandlungen erhalten. Die Diagnose ist für sie oft auch eine beruhigende Bestätigung, dass sie mit ihrem Gefühl, dass ihr Kind anders ist, Recht hatten.

Dank einer eindeutigen Diagnose können sie sich informieren, und wissen, auf welche Schwächen und Schwierigkeiten sie sich allenfalls einstellen müssen, und andrerseits, wo auch die Stärken ihres Kindes liegen können. Die Diagnose ist wichtig, um assoziierte Erkrankungen aufzufinden oder auszuschliessen, und um die richtigen Therapien und die richtige Betreuung aufzugleisen. Last but not least geht es auch um den Zugang zu den Leistungen der IV, welcher auf einer eindeutigen diagnostischen Zuordnung beruht. Wir zeigen zwei Fallbeispiele und erklären, was ein Kinderarzt für eine rechtzeitigen Diagnose und eine gute Betreuung wissen sollte.

Fallbeispiel 1

Max wurde mit normaler Geburtslänge und normalem Geburtsgewicht geboren. Nach der Geburt war beidseitig eine deutliche Ptose sichtbar. Er hatte tief angesetzte und abstehende Ohren. Er hatte keinen Herzfehler. Während des ersten Jahres nahm er wenig an Gewicht zu. Das Stillen dauerte lange, er wollte nicht. Max war schwerhörig, die ersten Worte sprach er mit 24 Monaten.  Seine motorische Entwicklung verlief allgemein verzögert. Aktuell hat er noch immer wenig Appetit und Gewicht pro Grösse liegt um die 3. Perzentile. Neues und Ungewohntes machen ihm Angst. Wegen einer ausgeprägten Frustrationsintoleranz wird er häufig in Konflikte verwickelt. Trotz einer eindeutigen muskulären Hypotonie kann er heute alle Sportarten ausüben.

Seit Geburt wurde er laufend von Ärzten und Psychologen untersucht. Eine genetische Abklärung im Alter von 2 Jahren lieferte keine Diagnose.  Im Alter von 7 Jahren wurde seine Mutter im Tram von einer anderen Frau darauf aufmerksam gemacht, dass ihr Sohn ein Noonan Syndrom haben könnte (Abbildung 1). Eine erneute genetische Untersuchung bestätigte die Diagnose auf Grund einer Mutation im SOS-1 Gen. Die Eltern verstehen bis heute nicht, weshalb keine der Fachpersonen zuvor das Syndrom erkannt hatte. Endlich waren die Eltern in der Lage, die Probleme und das Verhalten von Max besser zu verstehen.

Abbildung 1
Junge im Alter von 10 Jahren und 6 Monaten mit typischen Gesichts-Dysmorphiezeichen: Epikanthus, Hypertelorismus, schräg nach unten verlaufende Lidspalten, Ptosis und tief angesetzte Ohren.

Fallbeispiel 2

Ruben kam mit einem Geburtsgewicht von 4.4 kg und einer Geburtslänge von 51 cm zur Welt. Sein Gesicht war auffällig: Ptose, Hypertelorismus, dreieckiges Gesicht. Pectus excavatum. (Abbildung 2) Muskuläre Hypotonie. Die Ernährung war vor allem während der ersten zwei Jahre sehr schwierig, er erbrach oft und viel. Er wuchs sehr langsam. Länge und Gewicht lagen mit 3 Monaten unterhalb der 3. Perzentile. Auf dem Echokardiogramm fand man eine Pulmonalstenose. Der klinisch gestellte Verdacht auf Noonan Syndrom bestätigte sich bei der genetischen Untersuchung mit einer Mutation im PTPN-11 Gen. Die psychomotorische Entwicklung war global verzögert. Bei der Abklärung der kleinen Körpergrösse fand man ein niedriges IGF-1. Mit einem Arginintest konnte ein Wachstumshormonmangel ausgeschlossen werden. Er konnte in Holland mit Wachstumshormon behandelt werden. Sein Aufholwachstum war eindrücklich, die Pubertätsentwicklung begann mit 14 Jahren. Mit 19 Jahren war er 180 cm bei einer familiären Zielgrösse von 187 cm.

Abbildung 2
Säugling mit Noonan Syndrom. Ptose, Hypertelorismus. Tiefstehende Ohren, dreieckiges Gesicht. Trichterbrust.

Klinische Diagnose

Auch heute dauert es manchmal noch lange bis ein Noonan-Syndrom diagnostiziert wird. Nicht alle Fälle sind so typisch wie das Fallbeispiel 2. Daher ist es wichtig, die häufigsten Merkmale und die diagnostischen Kriterien zu kennen.

Pränatal
Pränatal bestehen oft Ödeme, die sich als erhöhte Nackentransparenz, als Hydrops fetalis und/oder als Pleuraerguss manifestieren können.

Gesicht
Postnatal liefern Gesichtsdysmorphien die ersten Anhaltspunkte (Abbildung 1 und 2), aber diese zeigen eine Variabilität in der Ausprägung und eine erhebliche Veränderung mit dem Alter. Wichtige Gesichtsmerkmale beim Neugeborenen sind eine breite und hohe Stirn, ein Hypertelorismus, Epikanthus und nach unten verlaufende Lidspalten mit einer Ptose, Mikrognathie und tief angesetzte, nach hinten gedrehte Ohren. In der Kindheit wirken die Gesichtszüge oft grob und das Gesicht ist langgezogen. Erwachsene haben prominente Nasolabialfalten, einen hohen vorderen Haaransatz, dicke Augenlider und faltige Haut²⁾.

Herz
Angeborene Herzfehler sind ein zweiter Anhaltspunkt für die Diagnosestellung. Die häufigsten kardialen Anomalien sind Stenose der Pulmonalklappe, hypertrophe Kardiomyopathie, Vorhofseptumdefekt und Ventrikelseptumdefekt¹⁾. Das EKG  zeigt in der Regel ein typisches Muster mit Linksachsenabweichung.

Verlauf in den ersten Lebensjahren
Den Eltern bleiben meist die Ernährungsprobleme in den ersten 2 Jahren in Erinnerung. Die häufigsten Probleme sind schlechtes Saugen, Trinkverweigerung, wiederkehrendes und schwallartiges Erbrechen, abdominale Distension und Verstopfung. Auffallend ist auch die psychomotorische Entwicklung, welche im unterschiedlichen Ausmass verzögert ist. Oft bestehen Probleme bei der Sprachentwicklung.

Weitere Hinweise
Bei der körperlichen Untersuchung sind ein Kleinwuchs, Thoraxdeformitäten, periphere Lymphödeme und ein Kryptorchismus weitere Anhaltspunkte. Weil in 50 % der Fälle das Noonan Syndrom familiär ist, kann die klinische Beobachtung der Eltern einen wichtigen Hinweis für die Diagnose bieten. Es wurden bisher mehrere Scoring-Systeme beschrieben: Im Jahr 1994 entwickelten van der Burgt et al. ein Scoring-System, das im Jahr 2007 aktualisiert wurde³⁾

Genetische Diagnose

Die Diagnose wird durch eine genetische Analyse eines Gen-Panels gestellt, wobei in 20 % der klinisch diagnostizierten Fälle auch heute noch kein Gendefekt gefunden werden kann. Dieser Prozentsatz hat sich jedoch in den letzten Jahrzehnten deutlich verringert: Nach der Beschreibung des ersten Gendefektes PTPN11 2001, der an der Pathogenese des Noonan-Syndroms beteiligt ist, wurden mindestens 13 weitere Gendefekte entdeckt ⁴⁾.

Basiskenntnisse

Wenn die Diagnose gestellt ist, erwarten die Eltern, dass der Kinderarzt Hintergrundinformationen kennt, um die Familie angemessen beraten zu können. Wir werden darum die wichtigsten klinischen Kennzeichen besprechen, kurz den molekularbiologischen Hintergrund erläutern und Richtlinien für die Betreuung geben.

Wachstum
Zwischen 50% und 70% der Menschen mit Noonan-Syndrom haben einen Kleinwuchs (eine Körpergröße unterhalb der 3. Perzentile)¹⁾. Es wurden mehrere Studien durchgeführt, die zu Noonan-Syndrom-spezifischen Wachstumskurven führten^5,6). Bei der Geburt sind Gewicht und Länge normal oder liegen leicht unter dem Normbereich. Im ersten Lebensjahr ist ein rascher Perzentilenabfall zu beobachten. Im Alter von 2 bis 4 Jahren wächst der Durchschnitt der Kinder auf der dritten Perzentile gesunder Kinder. Mit etwa 10 bzw. 12 Jahren fällt die Körpergröße aufgrund der späten Pubertät unter den Normbereich ab. Der Pubertätswachstumsschub tritt mit einer Verzögerung von etwa 2 Jahren auf, und die Endgrösse wird am Ende des zweiten Jahrzehnts erreicht. Die mittlere Endgrösse bei Männern liegt um 165 cm und bei Frauen um 152 cm.^5,6). Die BMI-Werte sind normal oder niedrig⁶⁾. Es wird über verschiedene Mechanismen des Kleinwuchses beim Noonan-Syndrom hypothetisiert, «intrinsisch» als Teil des Syndroms, als Folge einer unzureichenden Wachstumshormonsekretion oder einer Wachstumshormonresistenz⁷⁾. Wachstumshormon-Stimulationsteste sind meist normal⁷⁾. Die Food and Drug Administration (FDA) hat 2007 in den USA die Behandlung mit rekombinantem humanem Wachstumshormon für Patienten mit Noonan-Syndrom zugelassen. In vielen Ländern werden kleine Kinder mit Noonan-Syndrom seit kurzem mit Wachstumshormon behandelt ohne dass ein Wachstumshormonmangel nachgewiesen sein muss. Das trifft auf die Schweiz noch nicht zu. Die Evidenz für die Wirksamkeit der Wachstumshormontherapie beim Noonan-Syndrom wird durch eine begrenzte Anzahl von unkontrollierten prospektiven Studien und eine zunehmende Anzahl von retrospektiven Studien erbracht^{8, 9)}. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Wachstumshormontherapie mit einer mittleren Dosierung von 50 Mikrogramm/kg/Tag (entspricht der Dosis beim Turnersyndrom) zu einem Zuwachs der Körpergrösse-SDS zwischen +1,3 und +1,8 SDS führt. Die Ergebnisse bei Jungen sind besser als bei Mädchen und die präpubertären Jahre der Behandlung sind sehr entscheidend für den Therapieerfolg¹⁰⁾. Der Erfolg der Wachstumshormonbehandlung hängt nicht davon ab, ob ein Wachstumshormonmangel besteht oder nicht¹¹⁾.

Psychomotorische Entwicklung und Verhalten.
Eine motorische Entwicklungsverzögerung besteht bei ca. 25%-45% der Kinder mit Noonan-Syndrom. Eltern von Kindern mit Noonan-Syndrom berichten über Ungeschicklichkeit. Die Sprachentwicklung ist meistens verzögert. Noonan-Syndrom-Patienten zeigen einen IQ von geistig zurückgeblieben bis überdurchschnittlich, mit einem leicht erniedrigten Durchschnittswert (mittlerer IQ ist 85). Lernprobleme sind in etwa einem Drittel der Fälle vorhanden, wobei die verbalen Fähigkeiten besser als die non-verbalen Leistungsfähigkeiten im Kindesalter sind ^12,13,14). Weitere Auffälligkeiten sind Aufmerksamkeitsprobleme (Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung), Probleme mit Exekutivfunktionen (Organisations- und Planungsschwäche), Stimmungsschwankungen, soziale Schwierigkeiten (z. B. verminderte Einsicht in soziale Situationen, mangelnde Interaktion mit Gleichaltrigen), Frustrationsintoleranz, sowie Alexithymie (Schwierigkeit, die eigenen Emotionen und die von anderen zu erkennen, zu differenzieren und auszudrücken.)¹⁵⁾. Bei fast der Hälfte einer erwachsenen Kohorte von Personen mit Noonan-Syndrom wurde eine Depression gefunden und behandelt. Trotz einer im Durchschnitt niedrigen Intelligenz hat fast die Hälfte der Kinder mit Noonan-Syndrom einen sonderpädagogischen Förderbedarf wegen der weiteren oben erwähnten Problemen.

Essen und Gewicht
Im Vergleich zur Normalbevölkerung ist das Gewicht im Verhältnis zur Körpergrösse erniedrigt⁶⁾. Diese Tatsache ist für Eltern oft beunruhigend und sie versuchen ihr Kind zu motivieren, mehr oder besser zu essen. Wir haben den Zusammenhang zwischen Ernährungsproblemen im ersten Lebensjahr und dem Wachstum untersucht. Das Wachstum wurde durch die Essensprobleme nur sehr geringgradig beeinflusst. Nach dem ersten Jahr hat die Ernährungslage meistens keinen Einfluss mehr auf das lineare Wachstum. Es ist wichtig zu betonen, dass ein niedriges Gewicht im Verhältnis zur Körpergrösse Teil des Phänotyps ist und das Bemühungen der Eltern, das Gewicht im Verhältnis zur Körpergrösse zu erhöhen, nicht erfolgreich ist und das lineare Wachstum nicht zusätzlich fördert.

Chronische Schmerzen
Viele Kinder und Erwachsene mit Noonan-Syndrom (50-65 %) klagen über chronische Schmerzen in den Extremitäten, im Rücken oder im Bauch¹⁶⁾. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Ursache eine unterschiedliche Schmerzverarbeitung auf zentraler Ebene ist¹⁷).

Genetik

Das Noonan-Syndrom ist das häufigste Syndrom unter den RAS-o-pathien. Die RAS-o-pathien sind eine klinisch definierte Gruppe von Syndromen, bei denen sich die jeweiligen genetischen Veränderungen auf einen bestimmten molekularen Signalweg – den RAS-MAPK-Signalweg – auswirken, der für das Wachstum und die Differenzierung der Zellen wichtig ist.

Mit anderen Worten haben die RAS-o-pathien tiefgreifende negative Auswirkungen sowohl auf embryonale als auch auf spätere Entwicklungsstadien¹⁸⁾. Eine Mutation im PTPN11-Gen ist eine der Hauptursachen für das Noonan-Syndrom ¹⁹⁾. So entwickeln sich beim Noonan Syndrom aufgrund einer Mutation im PTPN11-Gen die Pulmonalklappen übermässig, sind verdickt und verursachen eine Klappenstenose. Auch die Bildung des Gehirns wird beeinflusst. So ist z.B. das Verhältnis zwischen Astrozyten und Gliazellen im Gehirn verändert.Dies kann eine Funktionsstörung des Gehirns zur Folge haben.

In den letzten Jahren wurden Mutationen in verschiedenen Genen des RAS/MAPK-Signalwegs als Ursache des Noonan-Syndroms identifiziert, welche alle autosomal-dominant vererbt werden¹⁸⁾. In fast 80% der Fälle mit einem klinischem Noonan-Syndrom wird aktuell eine Mutation in einem der bekannten Noonan-Syndrom-Gene gefunden: PTPN11 in 50%; SOS1 in 10%-15%; RIT1 und RAF1 in 5%; KRAS in <5%; aber es gibt noch andere Gene, welche als Ursache des Noonan- Syndroms in Frage kommen ¹⁸⁾. Das LZTR1-Gen kann sowohl autosomal-dominant als auch autosomal-rezessiv vererbt werden. Es gibt ein gewisses Genotyp-Phänotyp Verhältnis. Kinder mit einer Mutation im PTPN-11 Gen sind z. B. kleiner als diejenigen mit einer Mutation im SOS-1 Gen, welche meistens eine normale Grösse haben. Kinder mit einer Mutation im RIT-1 Gen haben öfter eine Kardiomyopathie.

Zu den RAS-o-pathien gehören auch die Neurofibromatose Typ 1 (NF1), das Costello Syndrom und das kardio-fazio-cutanes (CFC) Syndrom. Es ist wichtig, eine genaue genetische Diagnose zu stellen, weil einige dieser Entitäten eine ausgeprägte Prädisposition für Tumorerkrankungen haben ¹⁸⁾. Auch Kinder mit Noonan-Syndrom haben, im Vergleich zu Kindern ohne Noonan Syndrom, ein 8-fach höheres Risiko für einen Tumor im Kindesalter²⁰⁾.

Leitlinien für die Behandlung

In der Besprechung haben wir Kriterien geliefert, um das Noonan-Syndrom bei einem Kind oder einem Erwachsenen einfacher diagnostizieren zu können. Nach Bestätigung der Diagnose durch einen Gentest, sollte ein Screening auf die häufigsten Komorbiditäten initiiert werden. Eine vollständige kardiologische Untersuchung (einschließlich Herzchokardiographie), eine Ultraschalluntersuchung der Nieren, eine Beurteilung des Wachstums und des Gewichts, sowie des Deszensus der Hoden, ophthalmologische Untersuchungen und eine Beurteilung des Gehörs sollten direkt nach der Diagnosestellung durchgeführt werden. Eine Entwicklungsbeurteilung sollte am Ende des ersten Lebensjahres und bei Eintritt in die Grundschule und in die weiterführenden Schulen erfolgen. Bei Bedarf braucht es eine psychosoziale Betreuung für Kind und Eltern. Eine Basisuntersuchung der Blutgerinnung sollte nach dem 5. Lebensjahr durchgeführt werden oder früher, wenn eine grössere Operation geplant ist. Entwicklungsverzögerungen, die durch die muskuläre Hypotonie verursacht werden, verbessern sich mit Ergo- und Physiotherapie. Die Beobachtung des linearen Wachstums und der Gewichtsentwicklung sollte anhand der Noonan-spezifischen Wachstumskurven erfolgen. Wenn nach dem Alter von 2 Jahren die Körpergrösse unter dem Mittelwert für Noonan-Syndrom-Standards liegt, sollte eine Beurteilung durch einen pädiatrischen Endokrinologen erfolgen. In der Schweiz wird die Wachstumshormontherapie aktuell nur bei nachgewiesenem Wachstumshormonmangel bezahlt. Daher sollten bei Kleinwuchs und IGF-1-Spiegel < -1 SD Wachstumshormonstimulationsteste durchgeführt werden. Die Schilddrüsenfunktion sollte alle 3-5 Jahre kontrolliert werden.

Es ist sinnvoll, im Erwachsenenalter erneut neuropsychologische Tests durchzuführen, wenn der Patient Symptome einer Stimmungs-/Angststörung aufweist.

Schlussfolgerung

Das Noonan-Syndrom ist eine hochvariable genetische Erkrankung mit den Hauptmerkmalen Gesichtsdysmorphien, Kleinwuchs, angeborene Herzfehler, Ernährungsprobleme im Säuglingsalter und Entwicklungsverzögerung. Die Diagnose wird oft verzögert gestellt, was zu Unsicherheit bei den Eltern und ungenügender Betreuung der Patienten mit Noonan-Syndrom führt. Die Kenntnis der Hauptmerkmale und Probleme beim Noonan-Syndrom und deren Behandlungsziele ist für alle Kinderärzte nützlich, um die Erkennung und Betreuung von Patienten mit Noonan-Syndrom zu verbessern.

–

Referenzen

1. Noonan JA. Noonan syndrome: An update and review for the primary pediatrician. Clin Pediatr. 1994;33:548-55.
2. Allanson JE, Hall JG, Hughes HE, Preus M, Witt RD. Noonan syndrome: the changing phenotype. Am J Med Genet. 1985;21:507-14.
3. van der Burgt I. Noonan syndrome. Orphanet J Rare Dis. 2007;2:4.
4. Rauen KA. The RASopathies. Annu Rev Genom Human G. 2013;14:355-69.
5. Ranke MB, Heidemann P, Knupfer C, Enders H, Schmaltz AA, Bierich JR. Noonan syndrome: growth and clinical manifestations in 144 cases. Eur J Pediatr. 1988;148:220-7.
6. Malaquias AC, Brasil AS, Pereira AC, Arnhold IJ, Mendonca BB, Bertola DR et al. Growth standards of patients with Noonan and Noonan-like mutations in the RAS/MAPK pathway. Am J Med Genet A. 2012;158A: 2700-6.
7. Noordam C, van der Burgt I, Sweep CG, Delemarre-van de Waal HA, Sengers RC, Otten BJ. Growth hormone (GH) secretion in children with Noonan syndrome: frequently abnormal without consequences for growth or response to GH treatment. Clin Endocrinol. 2001;54:53-9.
8. Noordam C, Peer PG, Francois I, De Schepper J, van den Burgt I, Otten BJ. Long-term GH treatment improves adult height in children with Noonan syndrome with and without mutations in protein tyrosine phosphatase, non-receptor-type 11. Eur J Endocrinol. 2008;159:203-8.
9. Osio D, Dahlgren J, Wikland KA, Westphal O. Improved final height with long-term growth hormone treatment in Noonan syndrome. Acta Paediatr. 2005;94:1232-7.
10. Romano AA. Growth and Growth Hormone Treatment in Noonan Syndrome. Pediatr Endocr Rev P. 2019;16:459-64.
11. Noordam K, van der Burgt I, Brunner HG, Otten BJ. The relationship between clinical severity of Noonan’s syndrome and growth, growth hormone (GH) secretion and response to GH treatment. J Pediatr Endocr Met. 2002;15:175-80.
12. Digilio MC, Lepri F, Baban A, Dentici ML, Versacci P, Capolino R et al. RASopathies: Clinical Diagnosis in the First Year of Life. Mol Syndromol. 2011;1:282-9.
13. Lee DA, Portnoy S, Hill P, Gillberg C, Patton MA. Psychological profile of children with Noonan syndrome. Dev Med Child Neurol. 2005;47:35-8.
14. Pierpont EI, Pierpont ME, Mendelsohn NJ, Roberts AE, Tworog-Dube E, Seidenberg MS. Genotype differences in cognitive functioning in Noonan syndrome. Genes Brain Behav. 2009;8:275-82.
15. Wingbermühle E, Egger J, van der Burgt I, Verhoeven W. Neuropsychological and behavioral aspects of Noonan syndrome. Horm Res. 2009;72:15-23.
16. Vegunta S, Cotugno R, Wiliamson A, Grebe TA. Chronic pain in Noonan syndrome: A previously unreported but common symptom. Am J Med Genet A. 2015;167:2998-3005.
17. Leoni C, Triumbari EKA, Vollono C, Onesimo R, Podagrosi M, Giorgio V et al.   Pain in individuals with RASopathies: Prevalence and clinical characterization in a sample of 80 affected patients. Am J Med Genet A. 2019;179:940-7.
18. Tajan M, Paccoud R, Branka S, Edouard T, Yart A. The RASopathy Family: Consequences of Germline Activation of the RAS/MAPK Pathway. Endocr Rev. 2018;39:676-700.
19. Tartaglia M, Mehler EL, Goldberg R, Zampino G, Brunner HG, Kremer H et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 2001;29:465-8.
20. Kratz CP, Franke L, Peters H, Kohlschmidt N, Kazmierczak B, Finckh U et al.  Cancer spectrum and frequency among children with Noonan, Costello, and cardio-facio-cutaneous syndromes. Br J Cancer. 2015;112:1392-7.